猪流行性腹泻病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响

【摘要】微丝是支撑细胞的蛋白纤维网架系统,在细胞迁移、胞内物质运输等细胞活动中起必不可少的作用。病毒作为严格的胞内寄生者,为了创造有利于自身入侵、复制和释放的环境,进化了多种与宿主细胞骨架相互作用的机制,从而达到顺利入侵、准确到达复制位点进行高效复制、以及快速、远距离传播的目的。而细胞微丝被干扰后,细胞内病毒的活动也会受到明显抑制。广义上的微丝骨架也包括紧密连接蛋白部分。猪流行性腹泻是一种急性、接触性、高度传染性消化道疾病,近年来给养猪业带来巨大经济损失。本文以猪小肠上皮细胞系IPEC-J2为试验对象,首次研究猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）与宿主细胞微丝骨架之间的相互作用,以及其对紧密连接的影响。填补猪流行性腹泻感染机理方面的研究空白,为日后进行猪流行性腹泻病毒的深入研究提供一定基础。1猪流行性腹泻病毒感染IPEC-J2细胞的病理变化本试验以vero细胞扩繁、TCID50为105.5/mL的PEDV试验材料,摸索合适的感染复数感染IPEC-J2田胞。以蔗糖密度梯度离心方法浓缩纯化病毒,电镜负染观察病毒形态。见大量散在的、形态完整的病毒粒子,病毒粒子形态呈圆形、椭圆形、肾形和多边形。以HE染色观察感染PEDV的IPEC-J2细胞,发现细胞肿胀变圆、折光性加强,细胞内出现很多小空泡；伴随空泡增多、逐渐合并形成大空泡,肿胀的细胞脱落、形成空隙；最终大量脱落的细胞碎片漂浮于细胞瓶中。RT-PCR方法检测PEDV的增殖情况,在感染6h后PEDV开始大量迅速增殖,12h达到最高峰,随后病毒量逐步下降。电镜观察IPEC-J2细胞感染PEDV的超微结构变化,通过扫描电镜观察可见细胞微绒毛大量脱落消失、微绒毛顶端膨大变圆、可见数根融合形成蘑菇样膨大。透射电镜结果显示微绒毛内部微丝束消失、细胞内部微丝束紊乱、线粒体空泡化严重,细胞核膜与病毒接触部分出现溶解,未接触部分核膜界限清晰。结果说明,病毒可以在IPEC-J2细胞上复制增殖,出现典型的空泡状病变,同时引起微绒毛脱落与细胞内部微丝骨架的紊乱。提示PEDV能够引起细胞内部微丝骨架的改变。2猪流行性腹泻病毒对紧密连接的影响本试验主要从细胞跨膜电阻的测定、肠上皮细胞旁路转运试验来研究PEDV对肠上皮细胞屏障的影响,间接反映紧密连接完整性；随后通过检测细胞紧密连接蛋白表达量来直接反映紧密连接的改变情况。PEDV感染IPEC-J2细胞的跨膜电阻值在感染后有短暂的上升,60min下降,直到12h电阻值再度高于正常对照组值。肠上皮细胞的细胞旁通道转运试验显示,随着感染时间的延长,荧光渗透性标记分子在细胞旁路转运量不断加大,转运率也逐渐增高。以Westernblot检测PEDV对IPEC-J2细胞紧密连接蛋白表达量的影响,发现紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin和Claudin-1）和粘附连接蛋白（E-cadherin）的表达发生了不同程度的变化。Claudin-1和ZO-1这两种蛋白的表达量下调显著。到了60min,除了E-cadherin的表达量基本正常外,其余三种蛋白的表达量均下降到了正常表达量的85%左右。结果提示,PEDV的感染对紧密连接蛋白的表达量影响较小,而结合PEDV对微丝的影响极为显著,我们推测,PEDV可能并不依赖紧密连接蛋白作为入侵受体,而是病毒引起微丝骨架的重组,诱发近微丝环的收缩,从而导致紧密连接蛋白的变动。3猪流行性腹泻病毒与微丝骨架的相互作用本试验主要探讨猪流行性腹泻病毒在感染过程中与微丝骨架之间的关系。以FTTC-phalloidin染色法对感染后的IPEC-J2细胞进行观察后发现,微丝骨架感染后发生有规律的变化,我们人为地将微丝的变化划分为五个不同时期：解聚一期（0-40min）,环膜期（60min）,解聚二期（80min-100min）,环核期（6h-48h）,凋亡期（72h）。解聚一期,微丝开始解聚,微丝在细胞内呈现绿色雾状；环膜期,部分微丝束开始恢复,在细胞膜下形成围绕细胞的环状高亮微丝束；解聚二期,微丝再次开始发生解聚,肌动蛋白弥散分布；环核期,微丝在细胞核附近堆积形成散乱的斑块,部分细胞在细胞膜下有一圈微丝形成的亮环,细胞间界限模糊；凋亡期,细胞大部分凋亡,脱落,残存的细胞微丝聚集浓染,为典型的凋亡细胞染色特征。以微丝稳定剂（Jas）和细胞松弛素D（CytoD）改变细胞微丝的状态,通过检测细胞内病毒的TCID50来反映病毒的侵染情况。Jas和CytoD都能够干扰PEDV入侵、复制和释放,CytoD影响PEDV复制和释放的效果更为显著（P<0.01）。结果提示,在PEDV感染宿主细胞的过程中,病毒能够影响微丝的分布,改变F-actin的数量,同时微丝对病毒有反作用,影响病毒的入侵、复制与释放。
【作者】高君恺；
【导师】杨倩；
【作者基本信息】南京农业大学，基础兽医学，2013，硕士
【关键词】猪流行性腹泻病毒；猪小肠上皮细胞系；微丝骨架；紧密连接蛋白；

【参考文献】
[1]陆宇.一类四阶边值问题解的存在性[J].广东工业大学学报,2014,02:70-74.
[2]袁俊.面向汽车零部件的虚拟装配技术研究[D].吉林大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[3]严捷.注意力障碍儿童的课堂注意特点以及教师应对方式研究[D].苏州大学,应用心理学,2014,硕士.
[4]赵军强.人工腱膜材料组织相容性的初步研究[D].青岛大学,骨科学,2003,硕士.
[5]左雅坤.中国蜡烛产业国际化战略研究[D].东北财经大学,国际贸易学,2012,硕士.
[6]耿明英.NF-κB在大鼠创伤性脑损伤中的表达及地塞米松干预性的实验研究[D].重庆医科大学,外科学,2004,硕士.
[7]杨遇春.铝-锂合金的发展现状和前景[J].轻合金加工技术.1993(05)
[8]李仁善.韩国高中汉语课程基本词汇分析及复习游戏设计[D].山东大学,汉语国际教育（专业学位）,2013,硕士.
[9]庄文贤.国产125MW机组420t/h锅炉提高经济性的一些措施[J].发电设备.1991(01)
[10]马芳.卢氏鸡IFN-γ成熟蛋白基因的克隆与原核表达产物处理方法研究[D].河南科技大学,兽医（专业学位）,2013,硕士.
[11]边雅静.人力资本对我国东西部地区经济增长的实证分析[D].河北大学,统计学,2003,硕士.
[12]熊辉.基于因特网的证券电子商务研究[D].汕头大学,2001.
[13]韩雪.人权保障视角下的任意侦查[D].中国政法大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[14]何江荣.世界银行贷款甘肃文化自然遗产保护与开发项目工作会议交替口译实践报告[D].西北师范大学,翻译,2014,硕士.
[15]赖国睿.汽车制造业焊接作业劳动者职业卫生相关权利保护研究[D].吉林大学,社会医学与卫生事业管理,2014,硕士.
[16]陈帅.科技计划项目全生命周期过程管理平台研究[D].杭州电子科技大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[17]陈宝厚.永葆开拓精神,再创新局面[J].石油地球物理勘探,1995,03:297-298.
[18]王宜昌.用重力水平二次导数解释逆断层[J].石油地球物理勘探,1989,02:229-231.
[19]王华明.医改背景下托管医院管理模式研究[D].南方医科大学,社会医学与卫生事业管理,2012,硕士.
[20]贾星星.禽病原性大肠杆菌E058株iucCiucD、iucD、iucDiutA基因突变株的构建及其致病性评价[D].扬州大学,预防兽医学,2011,硕士.
[21]王月华.蒙古冰草与航道冰草杂交后代选育研究[D].内蒙古农业大学,作物遗传育种,2004,硕士.
[22]黄芳倩.基于共生视角的企业技术联盟伙伴选择研究[D].广西科技大学,企业管理,2013,硕士.
[23]高辉,徐光辉,张锐,王哲人.实数编码量子进化算法[J].控制与决策,2008,01:87-90.
[24]赵帅.新媒体环境下政府对突发社会安全事件的舆论引导研究[D].沈阳师范大学,行政管理,2014,硕士.
[25]郝惠男.γ-TiAl/TiO_2界面的电子结构及合金元素对其影响的第一性原理研究[D].首都师范大学,凝聚态物理,2013,硕士.
[26]刘欣.射干润喉片制备工艺、稳定性及抗炎作用的研究[D].湖北中医药大学,中药学,2013,硕士.
[27]李曼,王大治.一种高效的挖掘SJEP的算法[J].计算机工程,2004,18:69-70+73.
[28]罗志虹,赵玉振,郭珺,罗鲲.正极材料与催化剂对锂空气电池性能的影响及相关研究进展[J].材料导报,2015,07:20-26+58.
[29]胡瑾.豪斯翻译评估模式在《茶馆》英译本中的可行性分析[D].外交学院,外国语言学与应用语言学,2014,硕士.
[30]高佳.盐酸决奈达隆原料药及其薄膜包衣片的质量控制研究[D].河北医科大学,药物分析学,2013,硕士.
[31]王晓.美国司法协会代表团访问河北省沽源监狱的口译实践报告[D].河北师范大学,翻译,2014,硕士.
[32]杨雪苹.高一学生数学错题管理的现状调查与研究[D].华中师范大学,学科教学,2014,硕士.
[33]唐昊,裴荣,周雷,谭琦.基于状态聚类的多站点CSPS系统的协同控制方法[J].自动化学报,2014,05:901-908.
[34]江卉.唐宋词调衍生关系研究[D].厦门大学,中国古代文学,2014,硕士.
[35]高飞.基于单目视觉的行人检测算法研究与实现[D].东北大学,计算数学,2010,硕士.
[36]曾蕾.不同杂交稻后期衰老过程中对增温增光胁迫及增N响应的差异[D].江西农业大学,作物栽培学与耕作学,2012,硕士.
[37]韩丹.纳米金催化剂的光催化性能研究[D].内蒙古大学,2012.
[38]张浩.楼宇定位与跟随系统设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[39]展之宽.基于KDJ和MACD指标的触发式基金定投设计和可行性验证[D].兰州大学,金融（专业学位）,2013,硕士.
[40]徐晓航.新时期公安消防基层部队奉献精神培育研究[D].吉林大学,学科教学,2014,硕士.
[41]航空工业发展研究中心胡燕萍陈亚莉.国防材料发展重点依赖高性能产品[N].中国纺织报,2015-05-13003.
[42]蒋嗣韬.基于Graphene条带的纳米结构电学传输性质研究[D].南京邮电大学,集成电路工程（专业学位）,2013,硕士.
[43]王红兴.柏林小号艺术探究[D].内蒙古大学,音乐学,2013,硕士.
[44]白志强.蒙古贞人和科尔沁文化的多样化[D].内蒙古师范大学,社会学,2013,硕士.
[45]郭晶.基于DSP的SVPWM逆变器的研究与实现[D].太原科技大学,控制工程,2014,硕士.
[46]郭勇朝.安阳传统民居的“三雕”艺术研究[D].湖北工业大学,设计艺术学,2013,硕士.
[47]李红梅,严正.用可再生能源充电的SMES装置在系统调频中的应用[J].电力系统自动化,2009,15:94-97+102.
[48]闫相斌,李一军,邹鹏,卢涛.动静态属性数据相结合的客户分类方法研究[J].中国管理科学,2005,02:95-100.
[49]陆云龙.阵列声波测井波场分离方法比较研究[D].中国石油大学（华东）,地球探测与信息技术,2012,硕士.
[50]颜端武,岑咏华,张炜,刘丽娟.基于Ontology的个性化信息服务系统框架[J].现代图书情报技术,2005,12:22-25.